Hintergrund
Forschende der Universität Barcelona (UB), des Institute for Advanced Chemistry of Catalonia (IQAC-CSIC), des Institute of Microelectronics of Barcelona (IMB-CNM-CSIC) und des Aragon Nanoscience and Materials Institute of Aragon (INMA) haben eine Methode entwickelt, RNA-Viren aus Patientenproben zu detektieren, ohne dafür Reverse Transkriptase oder Amplifikationsschritte zu benötigen: TENADA (Triplex Enhanced Nucleic Acid Detection Assay). Die Methode wurde im Fachjournal „International Journal of Molecular Sciences“ vorgestellt [1].
Unkomplizierter und schneller als der PCR-Test
Die Standardmethode für die Covid-19-Diagnose basiert aktuell auf der Polymerasekettenreaktion (PCR). Der Nukleinsäure-Nachweistest TENADA scannt RNA-Viren wie SARS-CoV-2, das Influenza-A-Virus (H1N1) oder das Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) unkomplizierter und schneller als der PCR-Test, sagen die Forschenden. Die Nachweisgrenze liegt bei etwa 0,01 nM (einige Femtomol) und ist damit ähnlich niedrig wie bei der (RT-)PCR.
Molekulare Haarnadeln fangen Virus-RNA ab
Die neue Methode basiert auf der Fähigkeit von Polypurin-Haarnadeln (Polypurine reverse-Hoogsteen hairpin [PPRHs]), die selektiv an virale RNA binden und eine hochaffine Triplex bilden können. Wenn diese Hybridstruktur mit einer molekularen Sonde verbunden und mit der Probe des betroffenen Patienten in Kontakt gebracht wird, erhält man ein Nachweissignal für den viralen Erreger.
„PPRHs sind unmodifizierte einzelsträngige DNA-Haarnadeln, die aus zwei spiegelnden Domänen aus antiparallelen Polypurinen bestehen“, erklärt Professor Carlos J. Ciudad vom Department für Biochemie und Physiologie der UB. „Diese Domänen, die durch eine Thymidinschleife miteinander verbunden sind, sind durch intramolekulare Umkehr-Hoogsteen-Bindungen verknüpft. Die molekularen Haarnadeln können über Watson-Crick-Bindungen spezifisch an Polypyrimidin-Sequenzen in einzelsträngiger DNA (ssDNA), doppelsträngiger DNA (dsDNA) oder RNA-Viren binden und so einen antiparallelen Triplex bilden.“
So funktioniert TENADA
Die neue Strategie nutzt zwei Oligonukleotide: eine Triplex-bildende PPRH-Haarnadel als Einfangsonde und ein markiertes Duplex-bildendes DNA-Oligonukleotid als Nachweissonde.
„Die triplexbildenden PPRH-Haarnadeln wurden so konzipiert, dass sie an SARS-CoV-2-Polypyrimidin-Sequenzen binden, während die Nachweissonden so konzipiert wurden, dass sie komplementär zu einer Region nahe der Zielstelle der Polypyrimidine sind. Auf diese Weise wird das Vorhandensein von SARS-CoV-2-RNA durch die Bildung eines ternären Komplexes auf der Oberfläche des Biosensors nachgewiesen“, erklärt Professor Verónica Noé (UB-IN2UB).
Das Vorhandensein gebundener Virus-RNA kann farblich in einem thermischen Lateral-Flow-Test dargestellt oder elektrochemisch im Biosensor nachgewiesen werden.
Vorteile der PPRH-Methode
Ein Vorteil der PPRH-Methode ist, dass sie ohne den Einsatz von reverser Transkriptase funktioniert und kein Thermozykler (PCR-Block) benötigt. Dennoch wird eine gleiche Sensitivität und Spezifität erreicht wie bei der RT-PCR. Zudem geht der Test schnell: Ergebnisse werden in weniger als einer Stunde geliefert.
Des Weiteren kann der innovative Nukleinsäure-Nachweis-Test bei Kenntnis der Genomsequenz des Erregers unproblematisch für den Nachweis beliebiger Erreger angepasst werden.
PPRHs wurden auch als Gen-Silencing-Tools für mehrere Gene beschrieben, die hauptsächlich an der Karzinomentstehung beteiligt sind und eine DNA-Strangverschiebung bewirken können. Derzeit wird untersucht, wie diese Eigenschaften in der Krebstherapie zu nutzen wären.
