Die Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen der Integrität der Darmbarriere und der Entstehung von Arthritiden häufen sich. So werden in der präklinischen Phase der rheumatoiden Arthritis intestinale Pathologien mit abnormaler Immunzellinfiltration und Dysbiose beobachtet. Die intestinalen Epithelzellen spielen mit ihren dichten Verbindungen via Tight Junctions eine besonders wichtige Rolle.
Eine eingeschränkte Integrität der Darmbarriere ist dabei mit Autoimmunität und systemischer Inflammation assoziiert. Welche Relevanz der Tod von intestinalen Epithelzellen bei der Entstehung von Arthritiden aber genau spielt, war bislang unbekannt.
Um ein Tiermodell für eine Arthritis zu generieren, injizierte ein Team aus Erlangen Mäusen Typ-II-Kollagen, was nach 36 Tagen eine Arthritis induziert. Eine Woche vor sowie am Tag der Entstehung der Arthritis wurden im Ileum eine bakterielle Translokation im Sinne einer Dysfunktion der Darmbarriere sowie der Tod von intestinalen Epithelzellen beobachtet, nicht aber im Kolon.
Veränderte Zelltodmechanismen des Darmepithels
Um die molekularen Mechanismen des Zelltods der Darmepithelzellen des Ileums zu untersuchen, wurden diese Zellen am Tag der Entstehung der Arthritis isoliert und ihre RNA sequenziert. Auffällig war eine signifikante Veränderung der Zelltod-Signalwege.
Hochreguliert war die Expression der Apoptose-Gene Caspase-3 und Caspase-8 sowie der Gene Ripk1, Ripk3 und Mlkl, deren Produkte als Schlüsselproteine an der Nekroptose beteiligt sind. Nekroptose ist ein RIPK3-abhängig regulierter Zelltod, der Charakteristika der Apoptose, wie die Aktivierung von Fas-Rezeptoren, und der Nekrose, wie die Selbstverdauung und proinflammatorische Effekte, vereint.
Daher stört die Nekroptose der Darmepithelzellen die Darmbarriere. Es entsteht eine mikrobielle Dysbiose und chronische Darmentzündung.
Rolle von Hypoxie und HIF im Darmepithel
Bei der weiteren Analyse der RNA-Sequenzierungsdaten fiel den Autoren eine deutliche Hochregulation von T-Zell-Differenzierungssignalwegen und des HIF-1α-Signalwegs (Hypoxie-induzierbarer Faktor) auf. Hypoxie entsteht bei intestinaler Inflammation durch den hohen Verbrauch von Sauerstoff. HIF-1α und HIF-2α werden durch Hypoxie aktiviert und führen zu einer Anpassung an Hypoxie unter anderem durch Steigerung der Erythropoetin-Synthese.
Bereits bekannt war außerdem, dass HIF-2α im Rahmen einer chronischen Darmentzündung über eine Verstärkung der Expression von Claudin-15 zu einer verminderten Dichtigkeit der Darmbarriere führt. HIF-1α hingegen stärkt die Integrität der Darmbarriere. Um zu überprüfen, ob diese Wirkung von HIF-1α auch in dem Arthritis-Tiermodell vorliegt, generierten die Autoren Mäuse mit einem für das Darmepithel spezifischen Hif-1α-Knockout.
Schwere Arthritis bei Hif-1α-Mangel
Tatsächlich präsentierten sich die Hif-1α-defizienten Mäuse mit einem schwereren Verlauf und früheren Beginn der Arthritis als Kontrollmäuse. Auch wiesen die Hif-1α-Knockout-Mäuse in den sekundären lymphatischen Organen mehr Th1- und Th17-Zellen auf sowie höhere Konzentrationen von Interferon-γ und Interleukin-17A im Serum.
HIF-Stabilisator wirkt protektiv
Wenn Mäuse mit dem HIF-Stabilisator Roxadustat behandelt wurden, reduzierte sich die klinische Schwere und die Inzidenz der Arthritis sowie die intestinale Entzündung verglichen mit einer Kontrollbehandlung. Unter Roxadustat-Behandlung kam es auch laborchemisch zu einer geringeren Entzündung.
Nun untersuchten die Autoren den genauen Wirkmechanismus von Roxadustat. Die Behandlung mit Roxadustat hatte keinen signifikanten Effekt auf die Expression von HIF-2α, aber die Expression von HIF-1α war deutlich reduziert. Histopathologische Untersuchungen zeigten, dass Roxadustat zu einem häufigeren Überleben der intestinalen Epithelzellen führte. Auch die Expression von Nekroptose-Genen war unter Roxadustat-Behandlung vermindert.
Mehr Nekroptose bei Hif-1α-Mangel
Interessanterweise führte andersherum der Hif-1α-Knockout im Arthritis-Tiermodell zu mehr Entzündung und bakterieller Invasion im Ileum sowie vermehrtem Zelltod der Darmepithelzellen verglichen mit Arthritis-Mäusen ohne Hif-1α-Defizienz. Auch hinsichtlich der Expression von Genen der T-Zell-Aktivierung und -Proliferation unterschieden sich diese Mäuse deutlich. Ebenfalls führte der Hif-1α-Knockout im Arthritis-Tiermodell, ebenso wie in Zellkultur, zu einer verminderten Expression von Apoptose-Genen und zu einer vermehrten Expression von Nekroptose-Genen.
Um zu beantworten, wie genau HIF-1α die Nekroptose von Darmepithelzellen hemmt, setzten die Autoren Dünndarm-Organoide von Hif-1α-Knockout-Mäusen und Kontrollmäusen hypoxischen Bedingungen aus. Die Organoide der Kontrollmäuse überlebten, Hif-1α-Knockout-Organoide hingegen zeigten eine deutlich gestörte Morphologie.
HIF-1α hemmt Transkription von Ripk3
In Genexpressionsanalysen zeigte sich eine verminderte Expression von Apoptose-Genen, aber erneut eine vermehrte Expression von Nekroptose-Genen in den Hif-1α-Knockout-Organoiden. Nun sollten Chromatin-Bindungsanalysen beantworten, welche Gene in ihrer Expression direkt durch HIF-1α als Transkriptionsfaktor reguliert werden. Tatsächlich inhibierte HIF-1α die Expression von Ripk3, dem Schlüsselmediator der Nekroptose, scheinbar direkt über seine Funktion als Transkriptionsfaktor.
Auch beim Menschen scheint die Nekroptose von Darmepithelzellen eine wichtige Rolle in Pathophysiologie der Arthritis zu spielen. So zeigten immunhistochemische Färbungen von Ileum-Biopsien von Patienten mit der Erstdiagnose rheumatoide Arthritis die spezifische Expression der Nekroptose-Gene RIPK1, RIPK3 und MLKL in den Darmepithelzellen.
RIPK3 vermittelt Effekte des HIF-1α-Mangels
Um die Relevanz von RIPK3 bei dem Zelltod von Darmepithelzellen und in der Entstehung von Arthritis zu untersuchen, generierten die Autoren Dünndarm-Organoide von Ripk3-Knockout-Mäusen. Interessanterweise überlebten die Ripk3-Knockout-Organoide in hypoxischen Bedingungen häufiger als Kontroll-Organoide und exprimierten weniger stark Nekroptose-Gene. Ebenfalls wiesen Arthritis-Mäuse eine geringere klinische Schwere und Inzidenz der Arthritis auf, wenn sie Ripk3-defizient waren.
HIF-1α-Expression im Darmepithel mindert Arthritis-Schwere
Insgesamt zeigt die Studie überzeugend auf, dass die Nekroptose von intestinalen Epithelzellen ein wichtiger Regulationsmechanismus bei der Entstehung von Arthritis ist. Dieser Prozess wird durch HIF-1α inhibiert, indem HIF-1α die Expression des wichtigen Nekroptosemediators RIPK3 hemmt. Durch die verminderte Nekroptose von Darmepithelzellen wiederum bleibt die Integrität der Darmbarriere besser erhalten und es entsteht weniger häufig eine schwere Arthritis.
Wichtig zu beachten ist dabei, dass der Großteil der Studienergebnisse durch Experimente im Tiermodell gewonnen wurde. Eine Übertragbarkeit auf die Pathophysiologie der Arthritis beim Menschen muss nicht gegeben sein.
